德國elementar / 2021年七月份電子報 –經由GC-C-IRMS 檢測運動員禁藥使用情況


 

前言

因新冠病毒 (COVID-19)所造成的全球疫情所致,原訂2020年於日本東京所舉辦四年一度的東京奧運 (Tokyo Olympics)延遲一年舉辦。在相關疫苗於2020年底陸續問世後,總算讓命運多舛東京奧運的舉辦露出一線曙光。現已確定於7/24舉行,各國好手在經過數年的訓練中,也將於此崇高的運動聖堂上呈現其戮力不懈的訓練成果。而歷屆奧運會中,各奧運主辦單位對於確保公平競技的最高原則,在運動員禁藥(Dopping)使用的情況,也就格外重視。

 

尿提取物的特定化合物穩定碳同位素分析是一種技術,它構成了世界反禁藥組織 (WADA) 要求的興奮劑控制標準分析的一部分,並在其技術文件 TD2016IRMS 中有所規定。 於1996年在美國亞特蘭大舉行的夏季奧運會上首次引入,並在1998年日本冬季奧運會的長野賽道上全面實施。合成睾酮通常由植物甾醇合成,與人體內自然產生的睾酮相比,δ13C 值更負。通過測量睾酮的 13C/12C 同位素比率和使用與穩定同位素質譜儀 (GC-IRMS)的氣相層析儀從尿液提取物中提取其代謝物,可以檢測其使用合成形式的內生性雄性類固醇 (endogenous anabolic androgenic steroids)。

 

WADA 檢測運動員中睾酮濫用的指南要求對睾酮 (T-testosterone) 和其他四種代謝物以IRMS進行分析,包括5α-雄甾烷二醇 (5α-adiol)、5β-雄甾烷二醇 (5β-adiol)、雄甾酮 (A-androsterone)和 Etiocholanolone (Et) )以及內生性參考化合物(ERC-endogenous reference compound),例如 孕二醇(Pgdiol)。ERC不受睾酮給藥或代謝的影響,並為運動員天然產生的類固醇的同位素組成提供基準值(δ13C 介於 -16 和 -24 ‰ 之間,取決於飲食和原產國)。ERC 和睾酮/代謝物之間的 δ13C(超過 3 ‰)的大偏差表示其為外部用藥。

 

AnthrovisION 技術

在追求公平競爭的過程中,即使是最少量的性能增強類固醇也是可檢測到的。 這對化合物特定穩定同位素質譜的應用提出了最高的分析要求。 AnthrovisION 提供最高水準的檢測、出色的層析性能和長期的分析穩定性,提供最佳工具以確保體育比賽保持公平。

 

AnthrovisION 是完整的氣相層析-燃燒-同位素比質譜 (GC-C-IRMS) 解決方案,符合 WADA 技術文件 TD2016IRMS。 該系統由以下各部分所組成:

 

  • 近 40 年來,安捷倫Agilent科技一直是體育藥物檢測分析儀器的領導品牌供應商。Elementar穩定同位素設備-是安捷倫科技的 VAR 合作夥伴,我們使用市場領先的 Agilent 7890B 氣相層析儀作為前處理接口,使用毛細管柱和氦氣作為載氣分離目標化合物。Agilent 7890B 配備分流/不分流進樣器和火焰離子化檢測器,但可以升級以包括其他進樣/檢測器技術,包括 Q-MS、QQQ-MS 或 ToF-MS。

 

  • GC-5 Furnace Interface 負責在 IRMS 分析之前將已分離的化合物轉化為 CO2。該過程對於最終系統性能至關重要,因為轉化過程必須沒有同位素分餾(即化合物 100% 定量燃燒成 CO2),同時保持分離化合物的層析完整性。由於採用微孔 (microbore)反應器技術,採用氧化銅爐反應物和全自動 O2 排放和補給,GC-5的性能脫穎而出,為歷時數個月的分析提供了卓越的穩定性能。

 

  • visION 是一款出色的穩定同位素質譜儀,負責分析生成化合物的同位素比率。 visION 提供完全自動化的儀器驗證程序,包括使用不同 CO2 氣體脈衝進行離子源調諧(Tuning)和線性檢查。該儀器還提供對方法和參數的各種訪問級別 (access levels),以便可以設置用戶層次結構以進行更深入的審核和 SOP 配置。visION 還擁有所有商業化儀器中最小的桌上型設計,使該儀器即使是最繁忙、擁擠的實驗室也將是最理想的選擇。

 

  • IONOS在穩定同位素數據處理方面提供了全新的體驗,並為反禁藥實驗室 (anti-doping laboratories)提供了許多強大的功能。所有數據處理都在IONOS軟體中完成,而非在外部電子表格軟體(Spreadsheet)中完成,這意味著所有數據處理都可以追溯到原始儀器數據。我們獲得專利的Peak mapping演算法能夠自動檢測、判別同位素標準,例如 USADA-33 和 USADA-34,然後自動對原始數據應用同位素校準,以便對所有數據進行一致校正。最後,我們的計算列功能能夠自動計算內生性參考化合物 (ERC) 和目標化合物 (TC)結合,並將它們標記為超出 TD2016IRMS 中規定的允許範圍。

 

 

睾酮相關類固醇尿代謝物的穩定碳同位素分析

診斷尿液代謝物和內生性參考化合物 (ERC) 以結合物 (conjugates)形式存在於尿液中,因此必須首先經由固相萃取 (SPE) 或高效液相層析 (HPLC) 進行提取、水解和純化。根據世界反興奮劑機構的規定,所有提取方法必須能夠針對 T、A、Et、5α-二醇和 5β-二醇以及 ERC。在分析之前,提取物通常被衍生化(例如乙酰化),但是隨著添加這些額外的碳,還需要進行質量平衡校正。

 

最近,久負盛名的 Laboratoire de contrôle du dopage, INRS, Canada, 開發了一種簡化方法,使用 GC-IRMS 準確分析睾酮相關類固醇的尿液代謝物的 δ13C值(Ouellet 等人,2013 年)。簡單來說,HPLC 純化步驟用於分離七種診斷性尿代謝物,包括 T、脫氫表雄酮 (DHEA)、5α-二醇、表睾酮 (E)、5β-二醇、A 和 Et,以及兩種內生性參考化合物 Pgdiol 和雄甾烯醇。 16-烯醇)。然後將所有類固醇與外部標準品(雄甾醇,ESTD)合併成三個部分,並經由 GC-IRMS 進行分析,無需任何衍生程序。為了確保數據的完整性,使用相同處理的原則應用了多層級同位素校正方法。

 

為了評估此方法,該團隊製作了陰性和陽性對照組樣品,並與一系列參考標準一起進行了分析。陰性對照組是來自一名未使用任何合成代謝雄激素 (AAS)的男性志願者的尿液,陽性對照組來自另一名因醫學原因接受庚酸睾酮的志願者。從這些樣品中觀察到的長期精度非常好,對照樣品的標準偏差為 0.5 ‰ 或更小,參考標準的標準偏差為 0.2 ‰ 或更小(表 1)。

 

表 1. 陰性和陽性對照樣品和參考標準品的長期精度(Ouellet 等,2013)。

 

圖 1. 來自 INRS 的標準混合物 B 的層析案例圖。 在 Isoprime House 分析。

 

表 2. 儀器在大範圍樣品濃度上的線性表現(Ouellet 等,2013)

 

結論

整體靈敏度、準確度、精確度和易用性使 AnthrovisION 成為在揪出競賽運動中使用非法藥物的理想選擇。由於我們與安捷倫的 VAR 合作夥伴關係,我們可以確保提供世界領先的層析解決方案,我們經由 GC-5 高溫爐接口的解決方案,其中分離的化合物以100%的回收率轉化為 CO2。另外,結合我們革命性的 IONOS 軟體,以各前處理設備集成端口 centrION 的 visION 提供無與倫比的自動化。

 

參考資料

Ouellet, A., N. LeBerre and C. Ayotte, A simplified and accurate method for the analysis of urinary metabolites of testosterone-related steroids using gas chromatography / combustion / isotope ratio mass spectrometery, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 27, 1739-1750, 2013.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23821567

 

WADA Technical Document (TD2016IRMS), Detection of synthetic forms of endogenous anabolic androgenic steroids by GC/C/IRMS.

https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medicine/td2016-irms

 

WADA Technical Document (TD2016EAAS), Endogenous anabolic androgenic steroids measurement and reporting

https://www.wada-ama.org/en/resources/sciencemedicine/td2016-eaas